Η πλοκή ξεκινά όταν ο Bruce Wayne φυλακίζεται στο Arkham City, μια απομονωμένη περιοχή της Gotham που έχει μετατραπεί σε ανοιχτή φυλακή υπό τον έλεγχο του καθηγητή Hugo Strange. Ο Strange γνωρίζει την ταυτότητα του Batman και σχεδιάζει να ενεργοποιήσει το Protocol 10, ένα σχέδιο μαζικής εξόντωσης των κρατουμένων. Παράλληλα, ο Joker, δηλητηριασμένος από τον δικό του φόρμουλα Titan, μολύνει τον Batman με το αίμα του, αναγκάζοντάς τον να βρει θεραπεία.

Καθώς ο Batman ερευνά, έρχεται αντιμέτωπος με πολλούς εμβληματικούς εχθρούς όπως Two-Face, Penguin, Mr. Freeze, Harley Quinn, Riddler και Ra’s al Ghul. Η ιστορία κορυφώνεται με την αποκάλυψη του Protocol 10 ως σχέδιο γενοκτονίας και την τελική μάχη με τον Joker, ο οποίος πεθαίνει όταν η θεραπεία καταστρέφεται. Το παιχνίδι τελειώνει με τον Batman να μεταφέρει το άψυχο σώμα του Joker έξω από το Arkham City, σε μια από τις πιο δραματικές σκηνές της σειράς.