Ο Ezio επιστρέφει και μάχεται ενάντια στο ισχυρό Templar Order. Τώρα, ως θρυλικός Master Assassin, πρέπει να ταξιδέψει στη Ρώμη, στο κέντρο της εξουσίας, της απληστίας και της διαφθοράς, προκειμένου να χτυπήσει στην καρδιά του εχθρού. Ο Ezio θα διοικεί μία ολόκληρη Αδελφότητα, η οποία θα συσπειρωθεί δίπλα του και μόνο δουλεύοντας μαζί θα μπορέσουν οι Assassins να νικήσουν τους θανάσιμους εχθρούς τους.

Το Assassin's Creed Brotherhood προσφέρει και ένα multiplayer στοιχείο εντελώς πρωτοποριακό, στο οποίο οι παίκτες θα είναι σε θέση να βοηθήσουν τους Templars, χρησιμοποιώντας την Abstergo για να εκπαιδευτούν στην τέχνη της δολοφονίας, έτσι ώστε να εξοντώσουν τους Assassins μια για πάντα. Οι παίκτες θα έχουν τη δυνατότητα να επιλέξουν από μια σειρά μοναδικών χαρακτήρων -κάθε ένας από τους οποίους διαθέτει τα δικά του όπλα και ξεχωριστές τεχνικές δολοφονίας - και να συνδυάσουν τις δεξιότητές τους ενάντια σε άλλους παίκτες από όλο τον κόσμο σε διαφορετικά game modes.